Заражение на хорионаллантоисную оболочку. Этот метод является одним из наиболее употребительных. Основное преимущество его в том, что ряд вирусов при размножении на хорионаллантоисной оболочке вызывают ее характерные изменения, образуя очаги поражения в виде беловатых пятен-бляшек различной морфологии.
Для заражения используют эмбрионы 10-12-дневного возраста. Обычно к хорионаллантоисной оболочке проникают, сделав отверстие в скорлупе над воздушным мешком или же на боковой стороне яйца.
Основные этапы заражения на хорионаллантоисную оболочку со стороны воздушного пространства:
1. Яйцо помещают на подставку в вертикальном положении
так, чтобы воздушный мешок находился наверх}"; проводят
тщательную стерилизацию скорлупы на тупом конце яйца.
2. Над центром воздушного мешка делают прокол скорлупы
с помощью препаровальной иглы.
3. В образовавшееся отверстие вводят браншу ножниц и
вырезают окно в скорлупе около 1,5см в диаметре. (При этом
нельзя допускать попадания кусочков скорлупы внутрь яйца).
4. Через сделанное отверстие виден внутренний листок
скорлупной оболочки, его осторожно надрывают глазным
пинцетом или иглой и отслаивают на небольшом участке (0,5-1
см 2), обнажив хорионаллантоисную оболочку.
5. Производят заражение хорионаллантоисной оболочки
путем нанесения на нее 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала
(например вируса осповакцины) с помощью пастеровской пипетки
или шприца.
6. Окошко в скорлупе закрывают специальной эластичной
пленкой, стерильным покровным стеклом или стеклянным
колпачком. Для прикрепления стекла и колпачка к скорлупе
пользуются расплавленным парафином.
Зараженные эмбрионы помещают в термостат в вертикальном положении и инкубируют в течение 2-3 суток, после чего производят вскрытие по следующим правилам:
1. Яйцо помещают на подставку так, чтобы воздушное
пространство было наверху, проводится стерилизация места
предстоящего вскрытия путем соответствующей обработки
спиртом и йодом.
2. Удалив пленку, покровное стекло или колпачек,
стерильными ножницами срезают скорлупу по границе воздушного
пространства.
3. Пользуясь пинцетом, снимают скорлупную оболочку.
Обнаженную хорионаллантоисную оболочку (на которой могут
быть видимые изменения) подрезают вдоль края скорлупы. Через
образовавшееся отверстие выливают все содержимое яйца в чашку
или лоток.
4. Оставшуюся внутри скорлупы хорионаллантоисную
оболочку осторожно извлекают пинцетом и помещают в
стерильную чашку с физиологическим раствором. Здесь ее
расправляют и изучают изменения, поместив чашку на темный
фон.
Для получения из хорионаллантоисной оболочки материала, содержащего вирус, ее нужно измельчить ножницами и затем растереть в ступке с кварцевым стеклом, добавив солевой раствор. Полученную суспензию центрифугируют при 2000 об/мин в течение 10-15 минут и надосадочную жидкость использую! в качестве вируссодержащего материала (требуется обязательная проверка на отсутствие бактериального загрязнения).
Заражение в аллантоисную полость. Этот метод
отличается своей простотой и ценен тем, что способствует значительному накоплению вируса. Для заражения обычно берут эмбрионы 10-И - дневного возраста. Основные этапы заражения в аллантоисную полость:
}. Яйцо помещают на подставку тупым концом кверху и проводят стерилизацию скорлупы над воздушным пространством.
2. В центре тупого конца делают прокол скорлупы с
помощью препаровальной иглы.
3. В отверстие вводят иглу шприца, содержащего разведение
вируса (например вируса гриппа). Иглу продвигают в
вертикальном направлении на 2-3 мм ниже уровня воздушного
мешка и затем вводят ОД-0,2 мл материала.
4. Отверстие в скорлупе заделывают с помощью
расплавленного стерильного парафина.
Заражённые эмбрионы выдерживают в термостате обычно в течение 2 суток. Перед вскрытием яйца помещают на ночь в холодильник при 4°. Вскрытие производится в следующем порядке:
1.Яйцо устанавливают на подставке так, чтобы воздушный мешок находился наверху, скорлупу над ним стерилизуют;
2. С помощью ножниц скорлупу срезают немного выше
границы воздушного пространства.
3. Осторожно удаляют пинцетом скорлупнуюоболочку, после
чего хорионаллантоисную оболочку прокалывают пастеровской
пипеткой в том месте, где нет сосудов, и насасывают аллантоисную
жидкость (ее удается набрать 5-6 мл).
4. Аллантоисную жидкость переносят в стерильную
пробирку, а часть засевают в бульон для проверки на
бактериологическую стерильность.
Метод заражения в аллантоисную полость часто применяют для культивирования вируса гриппа, а также паротита и осповакцины.
Заражение в полость амниона
Этот метод более труден для выполнения и применяется несколько реже предыдущих. Особенностью его является то, что при заражении некоторыми пневмотропными вирусами (например, вирусами гриппа, паротита), последние размножаются не только в клетках оболочки амниона, но и в дыхательных путях и легочной ткани эмбриона, куда проникает инфицированная жидкость. Для заражения используют эмбрионы 7-12 - дневного возраста. Заражение в амниотическую полость проводят открытым методом, когда для введения материала в скорлупе делается сравнительно большое отверстие, или же закрытым методом, когда заражение производят через прокол скорлупы.
Первый из них более травматичен, второй - менее надежен, так как, действуя вслепую, не всегда удается ввести иглу в полость амниона.
Техника открытого метода заражения:
1. Яйцо помещают на подставку и проводят стерилизацию
скорлупы в области тупого конца.
2. Над центром воздушного пространства в скорлупе
ножницами вырезают окошко величиной 2 см в поперечнике (как
для заражения на хорионаллантоисную оболочку).
3. Осторожно снимают внутренний листок скорлупной
оболочки с помощью пинцета, обнажая подлежащую
хорионаллантоисную оболочку.
Прорезают ножницами небольшое отверстие в
хорионаллантоисной оболочке в том месте, где нет кровеносных сосудов, и вводят в прорез глазной пинцет. Пинцетом захватывают оболочку амниона и вытягивают амниотический мешок над поверхностью хорионаллантоисной оболочки.
5. Удерживая- амниотическую оболочку в этом положении,
производят заражение в полость амниона, вводя шприцем 0,1-
0,2 мл разведения вируса.
6. Отверстие в скорлупе закрывают стерильным колпачком
или покровным стеклом, пользуясь для их фиксации и
герметизации яйца расплавленным парафином.
Зараженные эмбрионы инкубируют в течение 2 суток, выбраковывая погибшие в течение первых суток (наблюдения ведут через окошко в скорлупе). После вскрытия эмбрионы выдерживают в течение ночи в холодильнике при 4° С.
Техника вскрытия эмбриона при заражении в амниотическую полость:
1. Простерилизовав место предстоящего вскрытия, срезают
скорлупу немного выше края воздушного мешка.
2. Прокалывают хорионаллантоисную оболочку
пастеровской пипеткой и удаляют аллантоисную жидкость.
3. Захватив пинцетом амниотический мешок, прокалывают
его оболочку иглой шприца или пастеровской пипеткой и
насасывают амнистическую жидкость (от 0,5 до 1,5 мл). У
зараженного эмбриона жидкость должна быть мутной, между тем
как у нормального эмбриона она прозрачна.
4. Взятую жидкость переносят в стерильную пробирку, 0,1-
0,3 мл ее засевают в бульон для контроля на бактериологическую
стерильность.
Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.
Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.
Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.
Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.
При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.
Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.
Заражение эмбрионов.
I. Введение вируса в аллантоисную полость
- 1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для стерилизации участка вокруг точки заражения.
- 2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью зубоврачебного сверла, снабженного режущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким, чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но желательно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.
- 3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную полость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непосредственно под скорлупу.
- 4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количеством расплавленного воска.
- 5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необходимости переворачивать яйца.
II. Введение вируса в амниотическую полость
- 1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и проделывают небольшое отверстие, как показано на схеме.
- 2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в темной комнате так, чтобы был виден эмбрион.
- 3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие, а затем резким движением в направлении эмбриона -- в амниотическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно извлекают иглу.
- 4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным воском и инкубируют яйца, как указано выше.
Время инкубации.
Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.
Сбор вируса.
Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.
I. Сбор аллантоисной жидкости
- 1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и стерилизуют их поверхность спиртом.
- 2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением. Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ к аллантоисной полости.
- 3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами разрывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю яйца.
- 4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7--10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при 0 °С.
- 5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или --70 °С.
II. Сбор амниотической жидкости
- 1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец, как описано выше. Удаляют возможно большую часть^ скорлупы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.
- 2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-тическая полость должна остаться неповрежденной.
- 3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической полости по возможности более полно извлекают содержимое.
- 4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость.
Ожидаемый выход.
Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.
Цель занятия: ознакомить студентов с методами заражения куриных эмбрионов для культивирования вирусов.
Оборудование и материалы: куриные эмбрионы 9-12 дневного возраста инкубации, овоскоп, спиртовые тампоны, подставки для эмбрионов, пинцеты, ножницы, лейкопластырь, иглы, шприцы, простые карандаши, пробойники, иголочки, таблицы, схемы, мультимедийное оборудование, презентации MS Office Power Point по теме занятия.
Объяснение преподавателя.
Существенно влияет на размножение вирусов в эмбрионах метод заражения. Перед заражением инкубированные яйца про-свечивают, погибшие отделяют. На скорлупе яиц с живыми эмбрионами, кото-рые различают по красному цвету кровеносных сосудов и движению эмбриона, карандашом отмечают место заражения.
Заражают эмбрионы в стерильном боксе, имеющем рабочий стол, два табуре-та, подводку газа, водопровод и вакуум. Заражение в амниотическую полость проводят в затемненной комнате. Рабочее место должно быть хорошо освещено. Перед работой стол дезинфицируют. Для дезинфекции поверхности яиц под-готавливают антисептический раствор (70%-ный спирт, 2%-ный раствор йода) и обернутую ватой деревянную палочку, согнутый зубной зонд или бормашину для просверливания яичной скорлупы. Яйца заражают при помощи стерильных шприца для туберкулинизации и специальных игл. Место заражения на яйце заливают парафином. Для этого готовят парафиновые палочки: в пробирку, за-полненную расплавленным парафином, вводят стеклянную палочку, следя за тем, чтобы она находилась в центре пробирки до остывания парафина.
Когда парафиновая палочка понадобится, стенки пробирки нагревают на го-релке и за стеклянную палочку вытягивают парафин из пробирки. Подержав палочку над пламенем, расплавляют необходимое для закрытия отверстия в яйце количество парафина. Этот способ очень чист, и при нем не образуются пары парафина.
Кроме того, на рабочем столе в боксе размещают стакан со стерильными ватными тампонами, стакан с 3 % раствором едкого натра для использо-ванных инструментов и сосуд с раствором хлорамина для использованных стек-лянных предметов. В случае надобности можно приготовить подставку для яиц, небольшую эмалированную чашку и стерильные питательные среды. Подготов-ленный таким образом рабочий стол в течение 1-2 ч подвергают УФ-облучению .
Учитывая патогенность исследуемых вирусов, работы ведут в маске, резино-вых перчатках и защитных очках.
Существует шесть методов заражения эмбрионов. Наиболее часто используют заражение в аллантоисную полость и на хорионаллантоисную оболочку, реже - в амниотическую полость и в желточный мешочек и совсем редко - в тело зародыша и в кровеносные сосуды ХАО. Выбор метода определяется тропизмом вируса, а также целью заражения. При любом методе заражения вводят 0,1-0,2 мл инфекционного материала.
Заражение в аллантоисную полость.
При заражении этим методом хорошо размножаются вирусы гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей, везикулярного стоматита и др. Существует несколько вариантов метода.
Первый вариант. Эмбрион фиксируют вертикально тупым концом вверх. В скорлупе на стороне зародыша, а иногда с противоположной зародышу стороны на 5-6 мм выше границы воздушной камеры делают отверстие диаметром около 1 мм. Иглу вводят параллельно продольной оси на глубину 10-12 мм (рис. 16). После инъекции вируссодержащего материала иглу извлекают, а отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного стерильного парафина.
Рисунок 16. Заражение в аллантоисную полость (первый вариант) (по Николау)
Второй вариант. Сделанное в скорлупе над воздушной камерой отверстие используют лишь для выхода части воздуха. Отверстие же для самого заражения делают на участке бессосудистой зоны хорионаллантоисной оболочки (ХАО) со стороны зародыша. Иглу вводят на глубину не более 2-3 мм. Инъецируют инфицирующую жидкость в объеме 0,1-0,2 мл и закрывают отверстие парафином (см. рис. 17).
Заражение на хорионаллантоисную оболочку.
Этот метод заражения куриных эмбрионов чаще используют для культивирования эпителиотропных и пантропных вирусов оспы, инфекционного ларинготрахеита птиц, чумы плотоядных , болезни Ауески , катаральной лихорадки овец и др.
Такое заражение может быть выполнено через естественную или искусственную воздушную камеру.
Для заражения через естественную воздушную камеру эмбрион помещают в штатив вертикально тупым концом вверх и в скорлупе против центра воздушной камеры вырезают круглое окно диаметром 15-20 мм. Через это окно пинцетом снимают подскорлупную оболочку. На обнажившийся участок ХАО наносят 0,2 мм вируссодержащей суспензии (рис. 18), отверстие закрывают лейкопластырем или реже покровным стеклом, укрепив его расплавленным парафином.
Заражение через искусственную воздушную камеру применяют чаще первого, так как оно обеспечивает контакт вируссодержащего материала с большей поверхностью ХАО и, следовательно, ведет к образованию большего количества вируса.
Рисунок 17. Заражение куриного эмбриона в аллантоисную полость (второй вариант) (по Николау)
Рисунок 18. Заражение на ХАО через естественную воздушную камеру (по Николау и др.)
Рисунок 19. Заражение куриного эмбриона на ХАО через искусственную воздушную камеру (по Николау и др.)
Для заражения эмбриона этим методом его помещают в штатив горизонтально зародышем вверх. В скорлупе делают два отверстия: одно небольшое над центром воздушной камеры (предназначено для отсасывания из нее воздуха), а другое диаметром 0,2-0,5 см сбоку, со стороны зародыша. Сложность метода в том, что, делая второе отверстие, необходимо осторожно снять вначале кусочек скорлупы, затем скользящим движением, не повреждая ХАО, сдвинуть подскорлупную оболочку в сторону так, чтобы через образовавшийся дефект мог пройти воздух. После этого резиновой грушей через первое отверстие отсасывают воздух из естественной воздушной камеры (рис. 19, а).В результате через боковое отверстие наружный воздух устремляется внутрь, образуя искусственную воздушную камеру, дном которой является ХАО (рис. 19, б).
Через боковое отверстие на поверхность ХАО наносят инфекционную жидкость и отверстие закрывают кусочком лейкопластыря. Закрывать первое отверстие нет необходимости, так как внутренний листок подскорлупной оболочки при этом методе заражения не нарушается и продолжает выполнять роль барьера для микрофлоры окружающей среды.
Дальнейшую инкубацию эмбрионов, зараженных этим методом, проводят в горизонтальном положении боковым отверстием вверх.
Заражение в желточный мешок.
Большей частью им пользуются для размножения хламидий, а также вирусов болезни Марека , ринопневмонии лошадей, катаральной лихорадки овец и др. Заражают эмбрионы 5-7-дневного, а иногда и 2-3-дневного возраста (вирус лихорадки долины РИФ). Используют два варианта заражения.
Первый вариант. Эмбрионы помещают в штатив в вертикальном положении. Делают отверстие в скорлупе над центром воздушной камеры и вводят иглу на глубину 3,5-4 см под углом 45° к вертикальной оси в направлении, противоположном месту нахождения зародыша (рис. 20).
Рисунок 20. Заражение куриного эмбриона в желточный мешок (по Николау и др.)
Второй вариант. Иногда аналогичный путь заражения осуществляется на горизонтально укрепленном в штативе эмбрионе; при этом зародыш находится внизу, а желток над ним. Отверстие в скорлупе закрывают каплей расплавленного парафина.
Заражение в амниотическую полость.
Для этой цели используют эмбрионы 6 - 10-дневного возраста. Метод используется при культивировании вирусов гриппа, ньюкаслской болезни, ринопневмонии лошадей и др. Есть два способа заражения.
Закрытый способ. Заражение проводят в затемненном боксе. Яйцо помещают на овоскопе в горизонтальном положении зародышем вверх. Через отверстие в скорлупе над воздушной камерой вводят иглу с затупленным концом по направлению к зародышу. Доказательством того, что игла проникла в амнион, служит движение тела зародыша в направлении передвижения.
Открытый способ. Скорлупу над воздушной камерой срезают так, чтобы образовалось окно диаметром 1,5-2,5 см. Через него пинцетом под контролем глаза снимают подскорлупную оболочку. Затем анатомический (14 см) пинцет с сомкнутыми браншами ведут, продавливая хорионаллантоисную оболочку по направлению к зародышу. Когда пинцет достигнет его, бранши размыкают, захватывают амниотическую оболочку вместе с ХАО и подтягивают к окну. Удерживая левой рукой пинцет с фиксированной в нем оболочкой амниона, вводят вируссодержащий материал (рис. 21). Далее все оболочки опускают, окно закрывают лейкопластырем и эмбрион инкубируют в вертикальном положении.
Рисунок 21. Заражение куриного эмбриона в амнион открытым способом (по Николау и др.)
Заражение в кровеносные сосуды ХАО.
При овоскопировании 11- 13-дневных эмбрионов отмечают крупный кровеносный сосуд. По его ходу удаляют участок скорлупы, наносят 1-2 капли спирта, что делает на некоторое время подскорлупную оболочку прозрачной. Под контролем глаза на овоскопе иглу вводят в сосуд, что подтверждается его подвижностью при небольших боковых движениях иглы. Обнаженный участок подскорлупной оболочки закрывают кусочком лейкопластыря.
Можно материал в сосуды ввести и несколько отличающимся способом: срезают скорлупу над воздушной камерой, подскорлупную оболочку смачивают спиртом и в ставшие видными сосуды ХАО вводят материал. Отверстие закрывают кусочком стерильного лейкопластыря.
Описанные технические приемы экспериментального заражения куриных эмбрионов не единственные, а имеют различные варианты.
Заражение в тело зародыша.
Для заражения используют эмбрионы 7-12-дневного возраста. Известно два варианта метода.
Первый вариант. Заражают так же, как в амнион закрытым способом, с той лишь разницей, что берут острую иглу и на овоскопе показателем попадания иглы в тело считают подчинение зародыша движениям иглы.
Второй вариант. Заражают так же, как в амнион открытым способом: через окно в скорлупе подтягивают пинцетом тело зародыша. Материал вводят в головной мозг или определенные участки тела. При таких методах заражения бывает значительный процент неспецифической гибели эмбрионов.
Накопление вируса в курином эмбрионе
Перед дальнейшей инкубацией на скорлупе зараженных любым методом куриных эмбрионов простым (графитным) карандашом пишут, чем заражен эмбрион и когда, а если нужно, то и другие сведения. Зараженные куриные эмбрионы помещают в термостат для дальнейшей инкубации, в процессе которой происходят репродукция внесенных вирусов и их накопление в соответствующих структурах. Температура инкубации эмбрионов варьирует от 33 до 38 °С в зависимости от свойств вируса, которым проведено заражение. За эмбрионами ведут постоянное наблюдение, просматривают на овоскопе, отбирая павшие.
Гибель эмбрионов в первые 24 ч после заражения чаще всего обусловлена размножением грибов, бактериальной микрофлоры, внесенных в эмбрион вместе с инокулятом, или травмированием при заражении. Эта гибель считается неспецифической. В более поздние сроки эмбрионы гибнут в результате, как правило, размножения в эмбрионах вируса. Обнаружив погибшие эмбрионы, их сразу же переносят в холодильник с температурой 4 °С. Такие условия, с одной стороны, способствуют сохранению активности накопившегося в эмбрионе вируса, с другой - уплотнению тканей и запустению сосудов, что значительно облегчает последующее вскрытие.
Эмбрионы инкубируют до момента максимального накопления вируса. Для каждого вируса и даже штамма этот срок является определенным и варьирует в пределах от 2 до 7-8 сут. Так, для вируса ньюкаслской болезни штамма Н он составляет 2-3 дня, для того же вируса штамма В,- 5 дней, для вируса инфекционного ларинготрахеита птиц - 5 дней и т. д. Затем все эмбрионы умерщвляют охлаждением при 4 °С в течение не менее 3-4 ч и вскрывают.
Деэмбринированные яйца.
Воснове метода лежит удаление эмбриона из яйца в период, когда к его скорлупе изнутри полностью прилегает хорионаллантоисная оболочка. Если внутрь такого яйца добавить питательную среду, то образует-ся своеобразная культура ткани, в которой может размножаться вирус. Метод обладает рядом преимуществ: он позволяет получить более чистый вирус, чем в аллантоисно-амниотической жидкости, что важно для снижения аллергизирующих свойств вакцин, приготовленных из этого материала; отсутствие желточного мешка и, следовательно, содержащихся в нем специфических антител позволяет лучше размножаться некоторым вирусам. В некоторых случаях этот метод дает хорошие результаты в диагностических работах, так как при нем можно вводить большие количества исследуемого материала, что увеличивает возможность вы-деления вируса.
Метод предложил Бернкопф еще в 1949 г., но из-за трудностей применения широко не используется. Трудности эти связаны со свойством хорионаллантоисной оболочки в процессе инкубации отделяться от скорлупы, что снижает ценность культуры и затрудняет манипуляции получения вируса и замены пита-тельной среды.
Е. Гройель (1963) ввел ряд модификаций, которые позволили устранить эти трудности. Он предложил использовать 15-дневные и даже более старые яйца, которые в процессе инкубации следует часто переворачивать для равномерного развития оболочки на скорлупе яйца. При просвечивании обозначают границы воздушной камеры. Скорлупу отпиливают на 0,5 см выше этой линии, на край скорлупной оболочки наливают расплавленный парафин (56-58 С°), который застывая, фиксирует край яйца. Затем вырезают круглое отверстие в оболочке над зародышем, оставляя вокруг узкий ободок. Следующий этап - осторожное удаление зародыша из яйца. При этом яйцо следует удерживать в горизонталь-ном положении и медленно поворачивать. Таким путем находят сосуды, связы-вающие эмбрион с ХАО, и перерезают их ножницами. Если яйцо держать верти-кально, то зародыш своей массой оттягивает оболочку, отрывая ее обычно в области острого конца яйца. Попадание даже небольшого количества жидкости между ХАО и скорлупой вызывает полную отслойку оболочки в течение 1-2 дней.
После удаления зародыша оболочку, выстилающую яйцо, несколько раз про-мывают физиологическим раствором, охлажденным до 4-0°С, до тех пор, пока жидкость не станет прозрачной. Затем в полость яйца вводят 20 мл питательной среды, подогретой до 37 °С, и яйцо закрывают стерильным резиновым колпач-ком, предварительно погрузив его в парафин. Трубка с резиновой пробкой, вмонтированная в яйцо, обеспечивает как взятие, так и введение жидкости без опасности бактериального заражения. Такой биологический объект сохраняет жизнеспособность в течение нескольких дней.
По методике Йошино и других, полость деэмбринированных яиц заполняют раствором агара в растворе Хенкса. Заражают деэмбринированные яйца через трубку в колпачке.
Контрольные вопросы:
1. Строение куриного эмбриона.
2. Для чего используют куриные эмбрионы в вирусологии?
3. Каково строение развивающегося куриного эмбриона?
Оглавление темы "Посев бактерий. Методы культивирования бактерий. Признаки колоний.":Культуры органов для обнаружения вирусов. Куриные эмбрионы при диагностике вирусных инфекций. Заражение вирусом куриного эмбриона. Методы заражения вирусом куриного эмбриона.
Не все виды клеток способны расти в виде монослон, в некоторых случаях поддержание дифференцированных клеток возможно только в культуре органа . Обычно это суспензия ткани, обладающей специализированной функцией, также обозначаемая как культура переживающей ткани.
Куриные эмбрионы при диагностике вирусных инфекций
Куриные эмбрионы (рис. 11-20) - практически идеальные модели для культивирования некоторых вирусов (например, гриппа и кори). Замкнутая полость эмбриона препятствует проникновению микроорганизмов извне, а также развитию спонтанных вирусных инфекций. Эмбрионы применяют для первичного выделения вирусов из патологического материала; для пассирования и сохранения их, а также для получения необходимых количеств вируса. Некоторые возбудители (например, герпесвирусы) вызывают характерные изменения (по ним можно распознавать заболевание). Заражение проводят на хорион-аллантоисную оболочку, в амниотическую или аллантоисную полость либо в желточный мешок.
Заражение вирусом на хорион-аллантоисную мембрану . Обычно используют 10-12-суточные эмбрионы. Яйца просматривают в проходящем свете, отмечают локализацию воздушного мешка и выбирают область без сосудов. Осторожно удаляют фрагмент скорлупы, освобождают наружную оболочку и отслаивают её осторожным надавливанием. Затем делают отверстие у края воздушного мешка. При отсосе через это отверстие хорион-аллантоисная оболочка отслаивается от наружной оболочки. На неё наносят исследуемый материал, свободный от бактерий и простейших (пропущенный через бактериальные фильтры и обработанный бактерицидами). Заражение в амниотическую полость. Обычно используют 7-14-суточные эмбрионы, у которых после отслоения хорион-аллантоисной оболочки (см. выше) расширяют отверстие, захватывают пинцетом амниотическую оболочку и выводят через хорион-аллантоисную оболочку. Через неё в амниотическую полость вводят исследуемый материал.
Заражение вирусом в аллантоисную полость . 10-суточные эмбрионы заражают через отверстия, сделанные в скорлупе и подлежащих оболочках (см. выше).
Заражение вирусом в желточный мешок . Используют 3-8-суточные эмбрионы, у которых в этом возрасте желточный мешок занимает почти всю полость яйца. Заражение проводят через отверстие, сделанное в воздушном мешке.
Рис. 11-20. Схематическое изображение развивающегося куриного эмбриона
.
Наблюдение и учет результатов заражении вирусом куриного эмбриона
В качестве вируссодержащего материала можно использовать содержимое желточного мешка , аллантоисную и амниотическую жидкости либо весь эмбрион, нарезанный вместе с окружающими тканями на кусочки. Для выявления характерных поражений на хорион-аллантоисной мембране удаляют скорлупу и наружную оболочку. Затем мембрану извлекают и помещают в стерильную воду. Характер поражений изучают на тёмном фоне.
Эмбрионы используют в возрасте от 8 до 14 дней в зависимости от вида вируса, способа заражения. Размножение в куриных эмбрионах происходит в разных частях зародыша.Способы заражения: на хорионаллантоисную оболочку, в аллотоисную и амниотическую, желточный мешок, тело эмбриона.
29.Тканевые культуры.
В зависимости от техники приготовления 3 вида клеток:
Однослойные способны размножаться на поверхности химически нейтрального стекла в виде монослоя;
Суспензионные, размн-я во всем объеме питательной среды;
Органные-цельные кусочки органов и тканей, сохраняющие исходную структуру.
Приготовление первичной культуры клеток складываются из нескольких этапов: измельчение ткани, разъединение клеток, отмывание полученной суспензии от трипсина.
Индикация:
- цитопатичекое действие- видимые под микроскопом морфологические изменения клеток, вплоть до отторжения от стекла.
Вирусные включения- это скопление вирусных частиц или отделение компонентов вирусов в цитоплазме или ядре клеток.
Бляшки-ограниченные участки, состоящие из дегенеративных клеток. Они видны как светлые пятна на фоне окрашенных клеток.
Цветная проба
Гемадсорбция-способность культур клеток адсорбировать на своей поверхности эритроциты.
Интерференция.
30.Классификация, хим.Состав бактериофагов.
Бактериофаги- вирусы бактерий, обладающие способностью проникать в бактериальные клетки, вызывать их растворение. Имеют форму головастика, некоторые кубической нитевидной формы. Состоят из икосаэдрической головки и хвостого отростка. Внутри хвостого отростка цилиндрический стержень,снаружи- чехол, отросток заканчивается шестиугольной базальной пластинкой с короткими шипами. Фаги состоят из нуклеиновой кислоты и белка. У фагов имеющих форму сперматозойда, двунитчатая ДНК плотно упакована в виде спирали внутри головки. Белки входят в состав оболочки. Кроме структурных белков обнаружены внутренние белки, связанные с нуклеиновой кислотой и белки-ферменты, участвующие во взаимодействии фага с клеткой.
31. Процесс взаимодействия вирулентных фагов и чувствительной к ним бактериальной клетки
Вирулентные фаги могут только увеличиваться в количестве посредством литического цикла. Процесс взаимодействия вирулентного бактериофага с клеткой складывается из нескольких стадий: адсорбции бактериофага на клетке, проникновения в клетку, биосинтеза компонентов фага и их сборки, выхода бактериофагов из клетки.
Первоначально бактериофаги прикрепляются к фагоспецифическим рецепторам на поверхности бактериальной клетки. Хвост фага с помощью ферментов, находящихся на его конце (в основном лизоцима), локально растворяет оболочку клетки, сокращается и содержащаяся в головке ДНК инъецируется в клетку, при этом белковая оболочка бактериофага остается снаружи. Инъецированная ДНК вызывает полную перестройку метаболизма клетки: прекращается синтез бактериальной ДНК, РНК и белков. ДНК бактериофага начинает транскрибироваться с помощью собственного фермента транскриптазы, который после попадания в бактериальную клетку активируется. Синтезируются сначала ранние, а затем поздние иРНК, которые поступают на рибосомы клетки-хозяина, где синтезируются ранние (ДНК-полимеразы, нуклеазы) и поздние (белки капсида и хвостового отростка, ферменты лизоцим, АТФаза и транскриптаза) белки бактериофага. Репликация ДНК бактериофага происходит по полуконсервативному механизму и осуществляется с участием собственных ДНК-полимераз. После синтеза поздних белков и завершения репликации ДНК наступает заключительный процесс - созревание фаговых частиц или соединение фаговой ДНК с белком оболочки и образование зрелых инфекционных фаговых частиц.