Куриные эмбрионы -- очень дешевая и удобная система культивирования вирусов гриппа. В эмбрионах в той или иной степени размножаются почти все штаммы вирусов как человеческого, так и животного происхождения. Наилучшим образом адаптированные к этой системе лабораторные штаммы дают в эмбрионах достаточно высокие титры, или 10--10 БОЕ на 1 эмбрион). Кроме того, эмбрион изолирован от внешней среды, и поэтому для размножения в нем вируса не нужно создавать специальные стерильные условия.
Вирус обычно вводят в заполненную жидкостью аллантоисную полость яйца, откуда он может проникнуть в хорионаллантоисную оболочку и заразить образующие ее клетки. Вирусное потомство выходит в аллантоисную жидкость и может быть легко извлечено из яйца путем отсасывания этой жидкости. Некоторые штаммы, в частности новые природные изоляты, а также вирусы типа С плохо размножаются на хорио-каллантоисной оболочке, но размножаются при введении непосредственно в амниотическую полость; при этом вирус получает доступ к разнообразным тканям эмбриона, и образующееся потомство выходит в амниотическую жидкость, которую можно извлечь отдельно.
Вирус лучше всего размножается в 10--12-дневных эмбрионах. Следует закупать свежие оплодотворенные яйца и инкубировать их нужное время в лаборатории. Для этого не обязательно иметь специальное оборудование, однако инкубатор очень удобен. Тем не менее яйца можно успешно инкубировать и в обычном термостате во влажной атмосфере при 37 °С, если их регулярно переворачивать. Сортность яиц не имеет особого значения, но в отдельных случаях важно исключить возможность заражения яйца другими микроорганизмами; некоторые поставщики продают специальные незараженные яйца.
Перед заражением следует убедиться в том, что яйца действительно оплодотворены. Для этого достаточно рассмотреть яйцо вблизи яркого источника света в темной комнате. Через 4--5 дней после оплодотворения эмбрион должен быть ясно виден.
При стандартном пассировании лабораторных штаммов вирусный инокулят обычно представляет собой образец инфицированной аллантоисной или культуральной жидкости. Как правило, образцы перед использованием разводят солевым раствором Хэнкса до концентрации вируса 10--10 БОЕ/мл, поскольку введение в яйцо большого количества вируса способствует образованию ДИЧ. Если перед заражением разведенный вирус приходится хранить, то в раствор для разведения следует ввести желатин. Естественно, необходимо обеспечить стерильность вируса, используемого для заражения; в тех случаях, когда это затруднительно, к инокуляту добавляют антибиотик гентамицин.
Данные методы предполагают использование гомогенизации для измельчения образцов, низкоскоростного центрифугирования для их осветления и введение неразведенного супернатанта в амниотическую полость.
Заражение эмбрионов.
I. Введение вируса в аллантоисную полость
- 1. Яйца кладут на бок и протирают сверху спиртом для стерилизации участка вокруг точки заражения.
- 2. В скорлупе проделывают небольшое отверстие с помощью зубоврачебного сверла, снабженного режущим диском. Отверстие должно быть достаточно глубоким, чтобы в него можно было ввести иглу для инъекций, но желательно не повреждать внутреннюю мембрану скорлупы.
- 3. С помощью шприца с иглой № 25 в аллантоисную полость инокулируют 0,1 мл вируса, вводя при этом иглу непосредственно под скорлупу.
- 4. Отверстие в скорлупе запечатывают небольшим количеством расплавленного воска.
- 5. Зараженные яйца инкубируют в термостате во влажной атмосфере острым концом вниз. Во время инкубации нет необходимости переворачивать яйца.
II. Введение вируса в амниотическую полость
- 1. Тупой конец яйца стерилизуют, протирая спиртом, и проделывают небольшое отверстие, как показано на схеме.
- 2. Яйцо располагают вблизи яркого источника света в темной комнате так, чтобы был виден эмбрион.
- 3. Иглу № 23 длиной 4 см вводят в проделанное отверстие, а затем резким движением в направлении эмбриона -- в амниотическую полость. При этом вносят 0,1 мл вируса и осторожно извлекают иглу.
- 4. Отверстие в скорлупе запечатывают расплавленным воском и инкубируют яйца, как указано выше.
Время инкубации.
Оптимальное время инкубации, необходимое для получения максимального выхода вируса, зависит от конкретного штамма и должно быть определено экспериментально. Для некоторых штаммов вируса гриппа А, например вируса чумы птиц, максимальный выход достигается через 24--26 ч, в то же время большинство штаммов вируса гриппа А человека, а также вирусы типов В и С требуют 48--72 ч инкубации.
Сбор вируса.
Прежде чем пытаться извлечь из яйца вируссодержащую жидкость, рекомендуется охладить яйцо в течение 4--18 ч при 4°С или в течение 30 мин при --20 °С. При охлаждении эмбрион погибает, а окружающие его кровеносные сосуды сужаются. Таким образом, значительно уменьшается возможность контаминации вируссодержащей жидкости эритроцитами, которые могут связать часть вируса и тем самым уменьшить его выход. Если контаминации эритроцитами избежать все же не удается, потери вируса можно свести к минимуму, инкубируя материал 30 мин при 37 °С. В этих условиях вирионная нейраминидаза разрушает рецепторы эритроцитов, с которыми связывается вирус, и он освобождается.
I. Сбор аллантоисной жидкости
- 1. Яйца помещают на подставку тупым концом вверх и стерилизуют их поверхность спиртом.
- 2. Тупой конец яйца вскрывают, пользуясь при этом либо стерильным пинцетом, либо специальным приспособлением. Скорлупу вокруг воздушного мешка удаляют, открывая доступ к аллантоисной полости.
- 3. С помощью стерильного пинцета с тупыми концами разрывают хорионаллантоисную мембрану и отодвигают ее к краю яйца.
- 4. Эмбрион и желточный мешок осторожно отодвигают пинцетом и отсасывают аллантоисную жидкость пипеткой с широким концом. Из яйца среднего размера получают 7--10 мл бледно-желтой жидкости. Примесь желтка в аллантоисной жидкости мешает дальнейшей очистке вируса, поэтому при ее отборе следует избегать повреждения желточного мешка. Если вирус предназначен для биохимических исследований, например для анализа активности вирионных ферментов, аллантоисную жидкость следует собирать при 0 °С.
- 5. Аллантоисную жидкость осветляют центрифугированием 10 мин при 10 000 g и хранят супернатант при 4 или --70 °С.
II. Сбор амниотической жидкости
- 1. Поверхность яйца стерилизуют и вскрывают тупой конец, как описано выше. Удаляют возможно большую часть^ скорлупы, чтобы легко было извлечь содержимое яйца.
- 2. Хорионаллантоисную мембрану разрывают и выливают содержимое яйца в стерильную чашку Петри. При этом амнио-тическая полость должна остаться неповрежденной.
- 3. С помощью шприца с иглой № 25 из амниотической полости по возможности более полно извлекают содержимое.
- 4. Амниотическую жидкость осветляют и хранят так же, как и аллантоисную жидкость.
Ожидаемый выход.
Интенсивность размножения вируса в эмбрионах зависит от конкретного штамма. Дикие штаммы первоначально дают очень низкие титры, но после нескольких пассажей на эмбрионах титр значительно возрастает. Для разных лабораторных штаммов, адаптированных к размножению на эмбрионах, выход также существенно варьирует, но в большинстве случаев в аллантоисной жидкости накапливается 2000--5000, а иногда и до 20 000 ГАЕ/мл вируса. Очевидно, что адаптация к размножению в эмбрионах связана с селекцией генетических вариантов, поэтому следует иметь в виду, что результаты детального генетического и биохимического исследования штаммов, пассированных на эмбрионах, не обязательно характеризуют исходный изолят.
Для вирусологических исследований используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста (чаще всего 9-12 дневные , иногда 5-12 дневные).
Перед заражением определяют жизнеспособность эмбриона. При овоскопировании живые эмбрионы подвижны, хорошо виден сосудистый рисунок. Простым карандашом отмечают границы воздушного мешка. Заражают куриные эмбрионы в асептических условиях, стерильными инструментами, предварительно обработав скорлупу над воздушным пространством йодом или спиртом.
Методы заражения куриных эмбрионов могут быть различны: нанесение вируса на хориоаллантоисную оболочку, в амниотическую и аллантоисную полости, в желточный мешок, тело зародыша. Выбор метода заражения зависит от биологических свойств изучаемого вируса.
Существует два способа заражения куриных эмбрионов:
1) открытый – скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, при помощи острых ножниц срезают скорлупу, снимают верхний листок оболочки воздушного мешка и проводят заражение. Отверстие закрывают специальной стеклянной крышкой или скорлупой и герметизируют стерильным растопленным парафином.
2)Закрытый - скорлупу над воздушным мешком обрабатывают спиртом и йодом, делают колющим инструментом отверстие в скорлупе и вводят при помощи шприца с толстой иглой 0,1-0,2 мл вируссодержащего материала под контролем овоскопа. Отверстие закрывают стерильным расплавленным парафином.
Зараженные эмбрионы инкубируют в термостате 2-4 суток. Затем их охлаждают до 4ºС на протяжении суток для максимального сужения сосудов. Вскрывают в стерильных условиях, предварительно обработав скорлупу спиртом или йодом.
Индикация вируса в курином эмбрионе производится по гибели эмбриона, положительной реакции гемагглютинации на стекле с аллантоисной или амниотической жидкостью, по фокусным поражениям («бляшкам») на хорион-аллантоисной оболочке.
Культивировать вирусы возможно только в живых клетках. Для этого используют любую биологическую систему: животные организмы, куриные эмбрионы, культуры клеток. При выборе лабораторных животных необходимо выполнять следующие требования: - животные должны быть здоровы. Вновь поступивших в виварий содержат в карантине (мышей и крыс 14 дней, остальных - 21 день). Для исключения латентных (скрытых) инфекций вирусной этиологии.
Для всех животных выполняются требования: - животные должны быть чувствительными к данному вирусу; - возраст животного имеет большое значение: наиболее чувствительны молодые и новорожденные, но в некоторых случаях для выявления ярких клинических признаков болезни используют взрослых животных; - животные должны быть одного возраста и массы тела; лучше для этого подходят линейные животные, т.е. полученные в результате близкородственного скрещивания.
При вирусологических исследованиях применяют подкожное, накожное, внутрикожное, внутримышечное, внутрибрюшинное, внутривенное, пероральное, интраназальное, интрацеребральное заражение лабораторных животных.
Куриный эмбрион Куриный эмбрион
(КЭ) - куриный зародыш, находящийся на разных стадиях эмбрионального развития. В микробиол. практике используют для выделения, культивирования и идентификации вирусов, риккетсий и иногда бактерий. Для лабораторных целей отбирают свежие, оплодотворенные, с хорошо просвечивающей и не имеющей трещин скорлупой КЭ. Инкубацию проводят в гнездах штатива тупым концом яйца вверх в хорошо вентилируемых инкубаторах или термостатах при 37 -37,5 °С, относительной влажности 63-65%. Для заражения отбирают 4- 13-дневные эмбрионы с выраженными кровеносными сосудами, желточным мешком и подвижной тенью. Перед заражением скорлупу яиц обрабатывают спиртом, обжигают и в области введения (чаще над воздушной камерой) смазывают 2% йодной настойкой. Материал или иссл. к-ру вводят, вскрывая или не вскрывая скорлупу, в желточный мешок (риккетсий), в аллантоисную или амниотическую полости (большинство вирусов), наносят на хорион-аллантоисную оболочку. Реже к-ру вводят в тело эмбриона или в/в. Зараженные КЭ помещают в термостат в условиях и на сроки, к-рые зависят от вида микроба и целей исследования. Некоторые данные о результатах заражения можно получить при внешнем осмотре КЭ под микроскопом (инъекция сосудов, потеря подвижности и др.). Однако в большинстве случаев КЭ вскрывают. Для этого после обработки спиртом и йодной настойкой скорлупу срезают выше границы воздушного мешка, пастеровской пипеткой или шприцем отсасывают сначала аллантоисную, а затем амниотическую жидкость, избегая повреждения сосудов и желточного мешка. Эмбрион и хорионаллантоисную оболочку извлекают из скорлупы, помещают в стерильные чашки, промывают стерильной дистил. водой и осматривают. Дальнейший ход исследования эмбриона и его жидкостей зависит от вида микроба или вируса и целей опыта.
(Источник: «Словарь терминов микробиологии»)
Смотреть что такое "Куриный эмбрион" в других словарях:
ЭМБРИОТОКСИЧНОСТЬ - эмбриотоксичность, способность физических, биологических, химических и других агентов оказывать отрицательное действие на развивающийся эмбрион. Эмбриотоксическое действие различных веществ устанавливают путем воздействия ими на самок… … Ветеринарный энциклопедический словарь
Запрос «Куры» перенаправляется сюда; см. также другие значения. ? Домашняя курица … Википедия
Куры Куры украшение любого двора Научная классификация Царство: Животные Тип: Хордовые Класс … Википедия
Добрый день, дорогие читатели! Мы сегодня дадим описание, покажем фото и видео про развитие цыпленка в яйце по дням во время инкубации в домашних условиях и на птицефабриках. уверенно практикуется как в фабричных масштабах, так и на частных подворьях.
Но, несмотря на широкое распространение, мало кто задумывается о сложном механизме, заложенном на генетическом уровне, обеспечивающим рост и развитие цыпленка.
До сих пор встречается мнение, что птенец вырастает из желтка. В этой статье вы узнаете все секреты, скрываемые под , а также что за «страшный» смысл скрывается под словами аллантоис у цыпленка и амнион у цыпленка, и какую функцию они выполняют.
Развитие цыпленка в яйце по дням фото
Бластодиск
Развитие цыпленка начинается с бластодиска. Бласодиск – это небольшой сгусток цитоплазмы, находящийся на поверхности желтка. В месте нахождения бластодиска плотность желтка значительно ниже, что способствует неизменному всплыванию желтка бластодиском вверх.
Эта особенность обеспечивает лучшее прогревание в процессе инкубации. Оплодотворенный бластодиск начинает деление еще в организме курицы и к моменту снесения он уже полностью окружен бластодермой. Выглядит бластодиск как небольшое белое пятнышко размером около 2 мм.
Светлый ореол, кольцом окружающий зародышевый диск является бластодермой.
При попадании яйца в благоприятные окружающие условия, остановившееся после снесения, деление клеток продолжается.
Следует знать: Вопреки распространенному мнению, что овоскопирование можно проводить только с 6 дня инкубации, развитие бластодермы хорошо просматривается через 18-24 часа от начала инкубации. К этому моменту отчетливо видно затемнение диаметром 5–6 мм, легко перемещающееся при переворачивании яйца.
На 2 – 3 сутки инкубации начинается развитие провизорных оболочек:
- Амнион у цыпленка
- Аллантоис у цыпленка
Все они являются, по сути, временными органами, призванными выполнять функции обеспечения жизнедеятельности зародыша до момента его окончательного формирования.
Амнион у цыпленка
Представляет собой оболочку, предохраняющую зародыш от физического воздействия и высыхания, благодаря наполнению жидкостью. Амнион у цыпленка регулирует количество жидкости в зависимости от возраста зародыша.
Эпителиальная поверхность амниотического мешка способна наполнять водой полость с эмбрионом, а также обеспечивает отток жидкости по мере его роста.
Аллантоис у цыпленка
Один из временных органов, выполняющий множество функций:
- снабжение эмбриона кислородом;
- изолирует от эмбриона отходы жизнедеятельности;
- участвует в транспорте жидкости и питательных веществ;
- осуществляет доставку минеральных веществ и кальция от скорлупы к зародышу.
Аллантоис у цыпленка, в процессе роста, создает разветвленную сосудистую сеть, которая выстилает всю внутреннюю поверхность яйца и соединяется с птенцом через пуповину.
Дыхание цыпленка в яйце
Кислородообмен в яйце в зависимости от стадии развития цыпленка имеет различный механизм. На начальной стадии развития, кислород поступает из желтка напрямую в клетки бластодермы.
С появлением кровеносной системы, кислород поступает уже в кровь, по-прежнему из желтка. Но желток не может полностью обеспечить дыхание быстрорастущего организма.
Начиная, с 6 дня функция обеспечения кислородом, постепенно, перекладывается на аллантоис. Рост его начинается в сторону воздушной камеры яйца и достигнув ее, покрывает все большую внутреннюю площадь скорлупы. Чем больше растет цыпленок, тем большую площадь покрывает аллантоис.
При овоскопировании он выглядит как розоватая сеть, охватывающая все яйцо и замыкающаяся с острой его стороны.
Питание цыпленка в яйце
В первые дни развития эмбрион использует питательные вещества белка и желтка. Так как в желтке содержится целый комплекс минеральных веществ, жиров и углеводов, он способен обеспечить все первоначальные потребности растущего организма.
После замыкания аллантоиса (11 день развития), происходит перераспределение функций. Зародыш, становится крупнее и принимает положение вдоль длинной оси яйца, головой к тупому концу. Белок к этому моменту сконцентрирован в остром конце яйца.
Вес птенца вкупе с давлением аллантоиса обеспечивает смещение белка и проникновение его через амнион в рот зародыша. Благодаря этому непрерывному процессу обеспечивается быстрый рост и развитие цыпленка в яйце по дням во время инкубации.
С 13 дня минеральные вещества, которые использует цыпленок для дальнейшего развития, доставляются аллантоисом от скорлупы.
Следует знать: Нормальное питание цыпленка, способен обеспечить, только своевременно замкнутый аллантоис у цыпленка. Если, при его смыкании, в остром конце яйца, остался не покрытый сосудами белок, цыпленку не хватит питательных веществ для дальнейшего роста.
Положение яйца и развитие цыпленка
В последнее время все шире практикуется инкубация куриных яиц в вертикальном положении. Но такой способ не самым лучшим образом сказывается на развитии цыпленка.
При вертикальном положении, максимальный наклон при поворотах равен 45°. Этого наклона недостаточно для нормального роста аллантоиса и своевременного его смыкания. Особенно это касается крупных яиц.
При инкубации в горизонтальном положении поворот обеспечивается на 180°, что положительно влияет на рост аллантоиса и как следствие питание птенчика.
Как правило, пушистики, выведенные при вертикальном положении яиц, имеют вес на 10% ниже, чем выведенные при горизонтальном положении.
Значение поворачивания яйца для развития цыпленка
Поворачивание яиц во время инкубации необходимо на всех стадиях развития, кроме первых суток и двух последних. В первые сутки необходимо интенсивное прогревание бластодиска, а в последние сутки маленький пискун уже принял положение для пробивания скорлупы.
На начальных стадиях развития поворачивание яиц устраняет риск прилипания бластодермы или амниона к внутренней стороне скорлупы.
Поворачивание также способствует:
- сокращению амниона;
- равномерности прогревания яиц;
- принятию эмбрионом правильного положения;
- улучшению газообмена;
- своевременному смыканию аллантоиса;
- улучшению питания зародыша.
Теперь, после прочтения статьи, можно судить о сложности процессов, происходящих с маленьким петушком или курочкой во время его развития от нескольких клеток до маленькой птички. Этот процесс не менее сложен, чем развитие человеческого ребенка или, например, котенка в утробе матери, где гарантированы постоянные условия.
Развитие цыпленка в яйце по дням полностью зависит от внешних условий, обеспечение которых и является инкубацией.
Желаем всем удачного вывода желтых, серых и других пушистиков!
Подпишитесь на обновления сайта, чтобы первыми узнать куриные новости, которые помогут решить все проблемы.
Вот фото от нашей постоянной читательный Юлии Арептевой, цыпленок вывелся под !
В комментариях вы можете добавить свои фото кур несушек, петуха и цыплят! Или другой домашней птицы. Нам интересно, какой у вас курятник?
Понравилась статья? Поделись с друзьями в соц.сетях:
Присоединяйтесь к нам ВКонтакте, читайте про кур!
Большое значение в развитии вирусологии имело введение методов культивирования вирусов в куриных эмбрионах. Для репродукции вируса используют куриные эмбрионы 7-12-дневного возраста, инкубированные в термостате при 37 С. Необходимым условием для правильного развития зародыша является соблюдение определенной влажности воздуха, которую можно создать, поместив в термостат сосуд с водой. Культивирование вирусов в куриных эмбрионах проводится в разных местах эмбриона, который заражают:
1) на хорион-аллантоисную оболочку;
2) в аллантоисную полость;
3) в амниотическую полость;
4) в желточный мешок.
Заражение куриных эмбрионов проводят в боксе с использованием стерильных инструментов. Перед: заражением куриные эмбрионы двукратно протирают ватным тампоном, смоченным спиртом.
Заражение на хорион-аллантоисную оболочку . После дезинфекции яйца осторожно срезают кусочек скорлупы с тупого концы, снимают подскорлупную оболочку - при этом обнаруживается хорион-аллатиоисная оболочка. Инфекционный материал в количестве 0,1-0,2 мл при помощи шприца или пастеровской пипетки наносят па хорион-аллантоисную оболочку. После заражения отверсто закрывают колпачком и просвет между ним и куриным эмбрионом заливают парафином. На другой стороне яйца простым карандашом пишут название инфекционного материала и дату заражения.
Заражение в амниотическую полость. Яйцо овоскопируют и на боковой стороне выбирают участок, где хорион-аллантоис лишен крупных кровеносных сосудов. Этот участок отмечают карандашом. Яйца укладывают на подставку в горизонтальном положении, дезинфицируют и специальным стерильным копьем прокалывают отверстие и скорлупе на глубину 2-3 мм, через которое вводят на это же расстояние иглу с инфекционным материалом непосредственно в амниотическую полость. Для того чтобы вводимая жидкость не вытекала обратно, предварительно делают прокол над воздушным мешком. После чего оба отверстия заливают парафином.
Заражение в аллантоисную полость. Заражение производят и затененном боксе. Отмечают воздушное пространство, скорлупу над воздушным пространством дезинфицируют и через отверстие в скорлупе вводят по направлению к эмбриону иглу шприца с материалом. Если игла попала в аллантоисную полость, то наблюдается смещение тени эмбриона. После заражения отверстие заливают парафином.
Заражение, в желточный мешок. Скорлупу дезинфицируют. Яйцо помещают на подставку тупым концом вправо так, чтобы желточный меток был обращен вверх. Над воздушной камерой в центре прокалывают отверстие. Через отверстие в скорлупе в скорлупе в горизонтальном направлении на глубину 2-3 мм вводят иглу шприца, которая попадает в желточный мешок. Материал вводят в объёме 0,2-0,3 мл. После введения материала отверстие парафинируют.
Температурный режим и длительность инкубации зависят от биологических свойств данного вируса. Инфицированные яйца ежедневно проверяют, овоскопируют для проверки жизнеспособности эмбриона. Если эмбрионы погибают в первые сутки, то причиной этого обычно бывает травма при заражении. Такие яйца выводят из опыта. Наличие вируса в заражённом эмбрионе определяют по характерным изменениям хорион-аллантоисной оболочки зараженного куриного эмбриона. Вирусы, не обладающие гемагпотинирующей активностью, выявляют с помощью РСК. Для выявления вируса в аллантоисной или амниотической жидкостях зараженных эмбрионов ставят РГА.